発表のポイント
?细胞内の様々な现象を明らかにする上で有用な蛍光寿命画像を、焦点の走査无く、一括して取得可能な手法を开発した。
?44,400个にも及ぶ「光のストップウォッチ」を2次元空间に并べて、蛍光寿命を同时测定することに成功した。
?イメージ内での同时计测性が常に担保されるので、生きた细胞の动态観察が必要なライフサイエンス研究への応用が期待される。
蛍光物质に瞬间的な光を照射すると、発生した蛍光は直ちには减衰せず、その蛍光物质特有の减衰时间（蛍光寿命）をもって减衰します。この蛍光寿命を観测し、试料をマッピングする手法が蛍光寿命顕微镜(注１)です。蛍光寿命は、実験条件に依存しないので高い定量性が得られ、细胞内の蛍光分子の环境変化などを高感度に検出することができます。しかし、蛍光寿命顕微镜は点计测に基づいているため、画像取得には焦点位置の机械的走査（スキャン）が必要となり、高速な画像取得が制限されていました。
徳岛大学ポストLEDフォトニクス研究所の水野孝彦元特任助教?安井武史教授らと宇都宮大学オプティクス教育研究センターの山本裕紹教授の研究グループは、上記の課題を解決するため、デュアル光コムを光源に用いた蛍光顕微鏡を開発しました。本研究では、光コム(注２)の?超离散マルチ光チャンネル性?という光周波数モード列(注３)が等间隔に并ぶ特徴に着目し、ひと组の光コム（デュアル光コム）による光の轮唱（光ビート(注４)）と、光波长/空间/电気周波数の多次元変换を融合することにより、蛍光寿命と蛍光强度の顕微画像を焦点走査无く（スキャンレスで）高速に一括取得できる手法を开発しました。本手法により、细胞内での分子の広がりや动きをつぶさに测定することが初めて可能になり、生きた细胞の动态（ダイナミックス）の定量的観察が必要なライフサイエンス研究への応用が期待されます。
本研究は、科学技術振興機構（JST）戦略的創造研究推進事業 ERATO「美濃島知的光シンセサイザプロジェクト（JPMJER1304）」、科学研究費助成事業（19H00871, 26246031）、内閣府?地方大学?地域産業創生交付金事業［徳島県「次世代“光”創出?応用による産業振興?若者雇用創出計画（次世代ひかりトクシマ）」］、中谷医工計測技術振興財団（1802003）からの支援を受けて行われました。
本研究成果は、2021年1月1日14時（米国東部标準時）にアメリカ科学振興協会（American Association for the Advancement of Science）の電子ジャーナル「Science Advances」で公開されます。
発表内容
＜研究背景＞
细胞内における特定の场所や机能タンパク质について蛍光标识を行い、その蛍光强度を観察する蛍光顕微镜は、生きたままの细胞を観察するライブイメージング技术として広く利用されています。しかし、蛍光强度は、観测している蛍光物质の浓度以外に、光退色/励起光强度/励起波长/光学系などの実験条件によっても変化するため、定量的な评価は困难とされてきました。一方、蛍光物质に瞬间的な光を照射すると、発生した蛍光は直ちには减衰せず、その蛍光物质特有の减衰时间（蛍光寿命）をもって减衰します。この蛍光寿命を観测し、试料をマッピングする手法が蛍光寿命顕微镜です。蛍光寿命は、実験条件に依存しないので高い定量性が得られ、细胞内の蛍光分子の环境変化などを高感度に検出することができます。
蛍光寿命は、极めて高速な现象であるため、通常のカメラは利用できません。一点毎に蛍光寿命を高速光検出器で计测する手法（点计测）が、蛍光寿命顕微镜では利用されてきました。しかし、この场合、イメージを取得するためには、焦点スポットを机械的に走査（スキャン）する必要がありました。その结果、蛍光寿命イメージを高速に取得することは困难でした。
＜开発した手法の概要＞
徳岛大学ポストLEDフォトニクス研究所の水野孝彦元特任助教?安井武史教授らと宇都宮大学オプティクス教育研究センターの山本裕紹教授の研究グループは、デュアル光コム?ビートと多次元変換を用いて、44,400個にも及ぶ「光のストップウォッチ」を2次元空間に並べて同時測定することにより、蛍光寿命画像を焦点走査無く（スキャンレスで）高速に一括取得できる手法（デュアル光コム蛍光寿命顕微鏡）を開発しました（図1）。
図1 デュアル光コム蛍光寿命顕微鏡の概念図
従来の蛍光寿命顕微鏡（FLIM：fluorescence lifetime microscopy）では、レーザー光を用いた光ストップウォッチのサンプル焦点位置を機械的走査ミラーで少しずつずらしながら、順番に計測をしていました（図2上図）。その結果、サンプルの全面に光ストップウォッチを当てるのに時間がかかっていました。
开発した手法（デュアル光コム贵尝滨惭）では、以下の手顺に従って、蛍光寿命イメージを取得します（図2下図）。
①&苍产蝉辫;周波数间隔がわずかに异なる2つの光コムのビームを空间的に重ねて干渉させ、
明灭（変调）周波数が异なる44,400もの光ビート信号（デュアル光コム?ビート群）を生成します。
これにより44,400个の光ストップウォッチが生成できました。
②&苍产蝉辫;44,400个の光ストップウォッチを2次元平面に整然と并べるため、まず、デュアル光コム?ビート群を
VIPA（Virtually imaged phased array）に入射することにより、デュアル光コム?ビート群を複数の
グループに分けて垂直方向に展开します。
③&苍产蝉辫;次に、复数のグループに分かれて垂直方向に展开されたデュアル光コム?ビート群を回折格子に
入射することにより、各グループ内の光ビートを波长に応じて水平方向に分散させます。
その结果、デュアル光コム?ビート群を构成する个々の光ビートが2次元空间に展开され、
2次元の虹が形成されます。
④&苍产蝉辫;この2次元の虹は、サンプルの全面を覆うように照明されます。この时、位置毎に异なる周波数で
明灭しますので、周波数を计测すると位置を特定することができます。
⑤&苍产蝉辫;この同时照明によって蛍光が同时発生します。蛍光は、照明と同じ周波数で明灭しますが、
蛍光寿命に応じて位相がずれます。整然と并べられた44,400个の光ストップウォッチで、
明灭の位相ズレの空间分布を同时计测します。
⑥&苍产蝉辫;明灭周波数とイメージ画素の対応関係から、蛍光寿命イメージを一括取得することができます。
开発した装置の有用性を确认するため、蛍光性テストチャートを计测しました。図3（补）及び図3（产）は、デュアル光コム?ビート群（周波数多重化电気信号）の振幅と位相の周波数スペクトルを示しており、その凹凸が2次元イメージ情报を反映しています。これらの周波数多重化信号と2次元蛍光スポット群の1対1対応関係に基づいて画像化した结果、図3（肠）及び図3（诲）が得られました。これらのイメージは、蛍光性テストチャートの蛍光强度及び蛍光寿命を反映しており、本手法によってスキャンレスで蛍光强度イメージと蛍光寿命イメージの同时取得が可能なことを确认しました。
図2 測定原理。上図（1?3コマ目）：従来の計測法
下図（4?7コマ目）：今回开発した手法による蛍光寿命イメージの取得
図3 実験結果
＜社会的意义＞
本技术は、ライフサイエンス分野での利用が期待されます。例えば、同时计测性が担保された蛍光寿命イメージを取得することができるので、生きている细胞で内部の分子の动きをつぶさに観察することが可能になります。その结果、生命现象や生命机能解析に関する新たな知见を迅速に取得できると期待されます。また、新型コロナウイルス诊断でも利用される抗原検査などで、膨大なサンプルを同时に并列计测できるので、大量自动検査システムへの応用が期待されます。
＜用语解説＞
（注1）蛍光寿命顕微镜
蛍光物质に瞬间的な光を照射すると、発生した蛍光は直ちには减衰せず、その蛍光物质特有の减衰时间をもって减衰します（図础上段）。この时、蛍光强度がピーク値からその1/别（=36.8%）に减衰するまでの时间を蛍光寿命&迟补耻;といいます。一方、正弦波状に强度変调された光を照射すると、発生する蛍光强度も同じ周波数で正弦波変调されますが、蛍光の位相は蛍光寿命に応じて、励起光から遅れます（図础下段）。この位相遅れ（位相ズレ）&辫丑颈;と蛍光寿命&迟补耻;の関係は、図中式の関係で示せることからから、测定した位相遅れ&辫丑颈;より蛍光寿命&迟补耻;を算出できます。
図A 蛍光寿命測定
蛍光寿命顕微镜では、蛍光寿命の时间领域测定法（図础上段）あるいは
周波数领域测定法（図础下段）を用いて、焦点スポットを机械的に走査（スキャン）
することにより（図叠）、蛍光寿命イメージを取得することができます。
図B イメージ取得のための机械的焦点走査
（注2）光コム（光周波数コム）
光コムは、数万本から数十万本にも及ぶ狭线幅な光周波数モード列（光コム?モード）が等间隔で櫛（肠辞尘产:コム）の歯状に整然と并んだ超离散マルチスペクトル构造を持っています（図颁）。この?超离散マルチ光チャンネル性?という特徴に、光波长/空间変换を适用すると、光コム?モードと2次元イメージ画素を1対1対応させることが可能になり、光コム?スペクトルから2次元イメージを取得することが可能になります。さらに、空间/电気周波数変换を利用すると、电気周波数信号として2次元イメージを読み出すことが可能になります。
図C 光コム
（注3）光周波数モード列
光周波数と光波长は反比例の関係にあり、両者の积は光速（=毎秒299,792,458メートル）に等しくなります。
（注4）光ビート
光は波の性质を有しているので、光周波数（光波长）が异なる2つの光が干渉すると、その光周波数差に相当したビート周波数を有する光のうなり（光ビート）が生じます。通常、光ビート周波数は、光周波数よりも极めて低周波で、光検出器で电気信号に変换することにより、电気周波数信号として得ることができます。
＜発表雑誌＞
雑誌名：Science Advances
論文タイトル：Full-field fluorescence-lifetime dual-comb microscopy using spectral mapping and frequency multiplexing of dual-optical-comb beats
著者：Takahiko Mizuno, Eiji Hase, Takeo Minamikawa, Yu Tokizane, Ryo Oe, Hidenori Koresawa, Hirotsugu Yamamoto, and Takeshi Yasui
顿翱滨番号：10.1126/蝉肠颈补诲惫.补产诲2102
＜ライセンス可能な特许＞
国内特许
発明の名称：计测装置及び照射装置
国际公开番号：奥翱2019/031584
出愿人：科学技术振兴机构
米国特许
発明の名称：MEASUREMENT DEVICE AND IRRADIATION DEVICE
特许登録番号：10837906
出願人：JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY AGENCY
ほか、中国、欧州へ特许出愿中
※新型コロナウイルス感染症対策の事业を行う事业者の皆様に対し、本特许ファミリーを无偿开放しています。
详细は奥别产サイト()をご覧ください。
